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La primera incursión española al Golfo de Guayaquil fue sin duda la de Pizarro y sus hombres a fines de 1531.
Cuando Pizarro llega al Canal del Morro (el Yagual de ese entonces), viniendo de San Matero (Esmeraldas), había pasado ya por Jipijapa, Salango, Coloche, y las tierras de Sumpa (Santa Elena).
El primer vehículo aborigen con el que los galeones españoles se toparon fue la balsa. Fabricadas para realizar tanto largas como cortas travesías, dueñas del Pacífico antes de la incursión del galeón, las balsas tuvieron una estrecha relación con Guayaquil y con su historia, no sólo por haber sido el principal medio de locomoción fluvial y marítimo de los pueblos antiguos, sino porque, a más de esto, ellas mantuvieron un vínculo extremadamente importante con los habitantes de la región por muchísimo tiempo, al punto que luego de trescientos años de fundarse la ciudad, todavía eran parte del paisaje fluvial que presentaba el río. Pruebas de este hecho son los grabados de la expedición en la que vino el sabio Humboldt, entre los que se incluyó uno de la famosa "balsa de Guayaquil”.
La colonización que hiciere Pizarro, originó el mestizaje que dio paso a la actual cultura, dándole carácter e identidad propia a un conglomerado humano protagonista de muchos de los principales cambios tempranos que la humanidad ha experimentado en esta región del planeta.
La Fundación de Guayaquil
 El 15 de agosto de 1534, Diego de Almagro, ante la amenaza de Pedro de Alvarado, asistido por Sebastián de Benalcázar se vio obligado a fundar en Liribamba la ciudad de Santiago de Quito. Trece días más tarde, el 28, por las mismas razones funda la villa de San Francisco de Quito. La Real Cédula del 4 de mayo de 1534, establecía que, toda fundación debía reunir las condiciones requeridas por la conquista. Caso contrario, recomendaba su traslado a otro lugar que sí las cumpliese. Esto ocurrió en ambos casos: San Francisco fue trasladada al lugar donde hoy es el territorio de Quito, el 6 de diciembre de 1534 y mantuvo así el topónimo.
Santiago, fundación igual de inútil, fue trasladada a la Costa para facilitar la logística requerida para la conquista del norte quiteño.
Benalcázar, autorizado por Pizarro remontó el Guayas, y la asentó en un lugar cercano a la boca del río Yaguachi sobre el río Amay (Babahoyo), y se la conoció como Santiago de Amay (1535). Asaltada e incendiada por los bravíos Chonos se mudó a la culata del río con el nombre de Santiago de la Culata (1536).
Nuevamente asolada, esta vez por la alianza de Chonos y Punáes, escapó a otro lugar y fue reconocida como Santiago de la Nueva Castilla (1537).
 En recurrencia trágica se refugió entre los Huancavilcas, "gente de paz" (1542), pero nuevamente debieron huir, esta vez a la vera de un pueblo indígena llamado "Guayaquile" (1543). Desde entonces es Santiago de Guayaquil y guayaquileños sus habitantes.
A raíz de la muerte de Francisco Pizarro (1541), su hermano Gonzalo se rebeló contra la Corona. Los vecinos leales al rey dirigidos por el capitán Francisco de Olmos, el 6 de abril de 1547, ajusticiaron al pizarrista y teniente de gobernador Manuel de Estacio.
Temiendo retaliaciones construyeron grandes balsas, y, encabezados por los capitanes Olmos, Rodrigo Vargas de Guzmán y Toribio de Castro, 140 personas con su menaje cruzaron el río Amay. Y, el 25 de Julio de 1547, día del apóstol Santiago patrono de la ciudad, atracaron en Las Peñas y asentaron la ciudad de la unión cimera de los cerros que hoy se conocen como Santa Ana y del Carmen.
A partir de entonces, luego de 13 años de trashumancia que parecía no tener final, cesan las luchas que un puñado de hombres sostuvo por aferrarse a su río como promesa de vida, movilidad y progreso. En el acta del cabildo celebrado el 24 de julio de 1781, el ayuntamiento dispone que el 25, día de la fiesta del Apóstol Santiago, también debía solemnizarse con el paseo del "Real Estandarte, en memoria de la conquista de la ciudad y su provincia".
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